AABB认证咨询--CAR-T细胞治疗的一般流程

            CAR-T治疗又称嵌合抗原受体T细胞治疗，是将人的T细胞经过基因工程手段体外修饰改造后，回输至患者体内，用于治疗疾病。

            目前生产CAR-T细胞疗法的主要步骤包括最初分离和富集T细胞、T细胞活化、使用病毒或非病毒载体系统进行CAR基因转移、体外CAR-T细胞扩增，CAR-T细胞质控以及最后的末端工艺和冷冻保存，整个制造周期一般需要2~4周。

CAR-T生产的各个阶段和工艺方案示例

分离及富集T细胞

 

       生产CAR-T的第一步，是通过白细胞分离术从患者（或同种异体的供体）处收集外周血单核细胞（PBMC）；然后利用基于磁珠的技术分离出特定的T细胞亚群，如CD4+、CD8+、CD25+或CD62L+T细胞。

 

CAR-T载体构建及包装

 

        实现CAR在T细胞上的表达是CAR-T生产的核心技术，这一步需要利用到载体将CAR基因导入T细胞。理想的载体应该具有较高的基因转染效率、稳定性好，不引起机体免疫反应等特点。

        目前有多种方法用于T细胞修饰，包括病毒载体转导 （如γ-逆转录病毒、慢病毒载体等）及非病毒载体转染（转座子转染、电穿孔等技术等）。其中慢病毒转导应用较为广泛。

慢病毒载体设计可以用来实现哪些实验目的？

• 通过引入组织特异性启动子和/或miRNA靶基因实现组织特异性表达，消除脱靶效应；
• 用单个载体表达多个蛋白质可以通过使用IRES、双向启动子或由自切割的2A多肽分开多可读框；
• shRNA和miRNA表达；
• 生成cDNA、shRNA和miRNA文库；
• 由药物调节的基因表达。

LV载体制备

 

       LV生产的上游工艺主要包括细胞培养 （分为悬浮/贴壁培养等）和病毒包装；下游工艺一般涉及澄清、纯化、过滤、浓缩、除菌等步骤。与细胞分离步骤一样，载体的无菌性至关重要，因为最终的CAR-T细胞产物无法通过过滤进行灭菌。

       EndoFree Plasmid Kits基于阴离子交换技术，将高效的内毒素去除步骤整合到质粒纯化流程中，不需要额外步骤，也不需用亲和柱去除脂多糖，可快速获得<0.1 EU/µg的质粒DNA。

       Oxford BioMedica为诺华Kymriah代工的慢病毒制造流程

 

T细胞扩增

 

        体外培养，大量扩增CAR-T细胞至治疗所需剂量，一般为十亿至百亿级别。

 

CAR-T细胞质控

 

          回输CAR-T细胞，严密监护病人，观察疗效并严密监测不良反应。

 

参考文献：

[1] Claire, Roddie, Maeve, et al. Manufacturing chimeric antigen receptor T cells: issues and challenges.[J]. Cytotherapy, 2019.[2] Levine B L, Miskin J, Wonnacott K, et al. Global Manufacturing of CAR T Cell Therapy[J]. Molecular Therapy Methods & Clinical Development, 2017, 4(C): 92-101.[3] Sakuma T, Barry M A, Ikeda Y. Lentiviral vectors: basic to translational[J]. Biochem J, 2012, 443(3): 603-618. [4] J.萨姆布鲁克, D.W.拉塞尔. 分子克隆实验指南[M]. 科学出版社, 2002.

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